干细胞新药研发难点
不同于传统药物，干细胞药物最本质的特点是其“活”的特性，在体外培养时对营养和环境要求极为严苛，且在移植入人体之后仍然具有增殖、分化、分泌活性物质的功能。
这为干细胞药物研发、生产和质量控制带来诸多难点，如：存储、运输条件严苛：需气相液氮存储，运输温度、震动均会对细胞活力产生影响；货架期短：新鲜干细胞制剂通常有效期在12~14小时；异质性：包括细胞来源、亚群差异、批间差异、非目的细胞对细胞活力产生影响；复杂性：工艺复杂、原辅包多样、质控内容繁多、床旁应用门槛高等因素；产量受限：单一供体可生产制剂数量有限，亟待开发规模化生产工艺。因此，如何开展干细胞药物制造工艺的研发，如何实现干细胞药物良好的质量控制，成为干细胞成药过程中最核心的环节。
质量源于设计（Quality by Design, QbD）是指以合理的科学和质量风险管理为依据，起始于预定的质量目标，注重对产品和工艺的理解及对生产工艺过程控制系统的研发方法（ICHQ8）。
在制药行业，最早由FDA在2003年发表的“Pharmaceutical cGMPs for the 21st century – A Risk Based Approach”报告中正式提出，并且被ICH纳入到自己的质量体系，用了Q8~Q11等多个章节来解释和阐述QbD的内涵和运用方法。不同于过去的“质量源于检验（Quality by Test，QbT，事后控制）”及“质量源于生产（Quality by Produce，QbP，事中控制）”，QbD是一种事前控制的工艺开发理念，意味着药品从研发开始就要考虑最终产品的质量。在基于知识和风险评估的基础上，对配方设计、工艺路线确定、工艺参数选择、物料控制等各个方面都要进行深入研究，积累翔实的数据，并依此确定最佳的产品配方和生产工艺。根据这种理念上的改变，要求药品质量监管的控制点要逐渐前移，从过去单纯依赖终产品检验，到对生产过程的控制，再到产品的设计和研究阶段的控制。简单讲，就是从源头上强化注册监管，确保药品质量和安全。使用QbD指导干细胞新药研发
干细胞药物研发应遵循药物开发的一般规律，需遵循《药品生产质量管理规范》及其附录、《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》《细胞治疗产品生产质量管理指南（试行）》《人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》及《中国药典》等一系列法规和指南要求，以管控污染、交叉污染、混淆和差错等四种风险，最终获得满足安全性、有效性和质量可控性的干细胞药品。从原料的采集、原代细胞的分离、种子细胞建库、原液生产到制剂灌装和临床应用，质量控制贯穿干细胞药物的整个生命周期。在使用QbD时，也应充分考虑每一关键工艺步骤所对应物料、中间产物和终产品的QTTP、CQA、CMA等，从而设计并选择合适的CPP，建立设计空间，以获得工艺的稳健性和产品质量的稳定性。
图3. MSC药品研发实行QbD的简要过程
QTPP系统描述了MSC产品的临床用途、安全性和有效性，是QbD的起点，缺乏明确定义的QTPP会导致时间和资源的浪费。因此，应基于对产品的理解来确定MSC药物的QTPP。MSC产品作为一种药物，首先应考虑其预期临床用途，根据目标适应证，谨慎选择给药途径（如静脉输注、局部注射、外敷等）、细胞产品剂型（输液剂、注射剂等）、处方组成（复方电解质、生理盐水、人血清白蛋白等）和有效期（冷冻制剂和新鲜制剂有效期的研究和确定），并确定成品的外观、装量、pH值、渗透压等标准。MSC的鉴定又包括来源鉴定（如种属来源、单一个体来源、取材组织来源等）和细胞标志物鉴定（如细胞形态、表面分子标志物等）。有效性指标又包括MSC的一般生物学特性及针对特定适应证的生物学有效性指标。一般生物学特性主要包括如细胞活率、细胞活力、直径、生长曲线、细胞周期、克隆形成率等基本生长特性，以及干性、多向分化能力、免疫调控能力、组织再生功能、基因修饰后的特定效力等。此外，研发人员还应根据目标适应证，采用转录组学、蛋白组学等方法，筛选与适应证治疗效果成正比的分子或蛋白标志物，用以评价产品治疗特定适应证的潜能。安全性是药物最重要的考察维度，MSC产品安全性考察指标主要包含两大类：生物学安全性。如纯度、目的表型与非目的表型、工艺相关杂质（如添加因子残留、高风险原材料残留、培养试剂残留、修饰工具残留）、成瘤性、致瘤性、促瘤性、异常免疫学反应和基因组稳定性（SNP、Indel、染色体核型）等；
微生物学安全性。主要包括细菌、真菌、支原体、内毒素、人源特异性病毒、内外源逆转录病毒、非特定病毒等。
▉ 识别关键质量属性（CQA）
研发人员应基于风险评估，识别直接影响产品安全性和有效性的CQA。MSC产品的CQA包括MSC产品的鉴定、纯度、生物学效力和安全性等4大维度。MSC产品身份的鉴定，对治疗效果至关重要，应确保包含具有特定治疗效果的预期细胞群体。2006年，国际细胞治疗协会（ISCT）给出了MSC定义的最基本定义，也就是最低的鉴定标准：从细胞形态，表面标记和分化能力三个方面定义了人类MSC的最基本标准。MSC细胞膜表面表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记；在体外诱导条件下，MSC可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞其中表面标志物的表达比例直接反映了MSC的纯度，并对MSC的有效性具有直接影响。因此，表面标志物的表达比例应当被纳入MSC产品的CQA进行考量。MSC产品中出现的杂质对于有效性和安全性有直接影响。杂质可能包括非目的细胞类型（影响治疗的有效性）、生产过程辅助材料的残留和可见异物（影响治疗的安全性）。MSC产品生物学效力的评价，离不开具体的适应证。比如开发针对GVHD药物，则可能需要重点考察MSC对淋巴细胞增殖的抑制作用，对T淋巴细胞亚型分化、巨噬细胞极化及炎性因子分泌的影响。Osiris公司在开发Prochymal时使用了T淋巴细胞增殖的抑制和TNFR1水平的测量，Prochymal是一种MSC产品，用于治疗儿童急性移植物抗宿主病（GVHD），在加拿大、新西兰和日本获得批准。近期Mesoblast将其重命名为Remestemcel-L并重新向FDA递交了BLA申请。如果开发针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的药物，则除了要考察免疫调控能力相关指标，还应增加促血管生成的相关指标（如分子或蛋白标志物、血管形成试验等）。安全性评价是细胞产品最重要的质量属性。MSC来源于成体，在天然体内环境下不具有成瘤性，然而经体外扩增培养后，尤其是经过较高代次的扩增，则有可能因基因突变的积累而导致成瘤性风险增加。因此，MSC产品成瘤性的评价应当纳入CQA进行考量。微生物的检测对MSC药品是强制性，无论采取开放式工艺还是封闭式工艺，均需要对MSC药品的无菌性、支原体、内毒素、内外源病毒等进行检测。
药物开发生产中稳定的物料来源，是至关重要的一环，应考虑物料在制剂中的用途，明确和理解物料对制剂产品研发产生影响的理化、生物学与微生物学属性或特性，并从中寻找物料的CMAs。在工艺流程中，当前一工序的输出物料成为下一工序的输入物料时，它输出时的CQA就可能变成输入时的CMA。因此，物料不仅仅指狭义的原始物料和辅料，还包含中间体。对于MSC药物来说，其关键物料主要包括原始的供体材料、用于生产制剂的原液（新鲜原液或冻存原液）、生产过程中用到的关键试剂（如培养基、消化酶、冻存液、缓冲液、复方电解质、生理盐水、人血清白蛋白等）。对于供体材料的CMAs，主要应考察其微生物学安全性，尤其关注人源特异性病毒（如HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等）。对于原液中间体（通常作为工作细胞库），则主要关注其在长期冷冻条件下的稳定性（如细胞活率、活力等）。对于关键试剂，除厂家提供的CQA之外，还应建立内控标准，对辅料的微生物学安全性进行质控。针对不同适应证，可能会选择不同的培养基，或添加特定的细胞因子或小分子化合物，甚至采用基因修饰的手段对细胞进行改造，这些物料的CMAs要结合具体工艺进一步识别和确定。
在QbD理念中，CPPs贯穿整个制剂生命周期，从研发、放大到验证，涉及每个工艺流程操作环节。ICH Q8中也提到“CPPs需要被识别和控制使得产品达到需要的质量属性目标”，所以CPPs也通常被建议用于研发生产环节及质量控制保证。就MSC产品的生产工艺而言，工艺参数主要分为两大类：第一类，主要包括对制药工艺优化至关重要的“传统”物理、化学等工艺工程参数；第二类，主要包括对干细胞命运决定和生物学特性至关重要的生物学范畴的工艺参数。对于第一类工艺参数（如温度、CO2浓度、溶氧浓度、pH、葡萄糖浓度、代谢物浓度等），可通过在线监测和控制，动态收集实时测量的数据，从而指导干细胞输出。研究显示，低氧（浓度≤5%）条件下培养的MSC，其免疫调控能力和促血管形成能力表现更出色，且低氧条件有助于减少细胞代谢产生的活性氧自由基的累积，减少细胞氧化损伤。培养物中，pH的变化通常与CO2浓度和代谢副产物有关，比如乳酸的积累导致pH下降，进而引起细胞生长受到抑制。培养基更换频率和营养交换方式（如搅拌、灌流、弃补液等），与细胞微环境中营养物质的可及性和代谢废物的及时排出息息相关，也会显著影响干细胞的生长状态。对于第二类工艺参数，主要体现在MSC培养方案的选择上，如培养基（动物血清、人血小板裂解物、成分确定的无血清培养基）、消化液（动物源的消化酶、原核表达的消化酶、无蛋白消化液等）、冻存液（含/不含DMSO）、培养方式（传统2D平面培养、3D悬浮式或灌注式规模化培养）、微载体（可降解/不可降解微载体、片状/球状、悬浮式/固定床式）。此外，还应对细胞接种密度、传代方式、添加生长因子或小分子的种类和浓度等进行摸索。同时，要充分考虑到MSC扩增倍数和细胞复制性衰老的关系，才能保证收获的MSC处于高活性状态。以上工艺参数的选择均会对产品的安全性和有效性产生影响，并且改变产品质量控制的范围。
干细胞药品的生产是一种高维的多因素输入和多因素输出的过程，多个CMAs输入，在多个CPPs的控制下，输出多个CQAs。三者之间的函数关系可用图4表示：既然CQA是在CMA和CPP之间的复杂相互作用下实现的，那如何确立输入最佳的CMA和CPP及其组合，以获得满足需求的CQA输出呢？此处主要引入DOE的方法开展试验设计。DOE是一种结构化、组织化确定影响工艺属性变量之间关系的方法。当试验设计用于生产工艺时，变量可以是原材料属性，也可以是过程参数。将不同的参数采用正交试验设计，制定科学合理而又能在尽可能少的试验次数中获得尽可能多的有价值的试验数据来指导工艺开发。比如对3个因素3个水平的输入，若使用传统的设计方法，对所有可能实验方案一一进行测试，则需要至少27次试验（还不包括重复）。而采用DOE的正交设计方法，则开展9次试验即可获得理想的实验结果（如图5所示）。这大幅提高了研发效率，降低了成本。图5. 正交试验设计举例
在MSC产品的生产中，可以采用DOE正交设计，高水平筛选出产生影响（或不影响）的MSC培养参数组合，使细胞生长增殖过程更稳健，并最终优化CQA。比如，对种子密度、培养基体积和换液时间等3个变量的不同水平进行设计，从而确定获得最佳细胞产量的条件。再比如，研究不同的培养方式（2D、3D、搅拌、固定床）及不同的培养基（品牌A、品牌B、品牌C）等不同的CPP和CMA组合，分析产物MSC的免疫调节能力、促血管形成能力的强弱，已获得最佳的培养基和培养方式的组合。需要注意的是，产品的CQA随着产品认知和工艺技术的发展而不断提升。因此，早期MSC产品开发时确定的CQA，会随着知识库的增长，以更优质的CMA和更优化的CPP为输入，通过更科学的DOE，获得更为优越的CQA，从而进一步提升工艺的稳健性和产品质量。这里就引出了设计空间（DS）的概念。ICH-Q8(R2)将DS定义为已被证明能保证产品质量的输入变量（如物料属性）和工艺参数的多维组合交互作用的范围。在通过试验设计探索CPP、CMA与CQA之间的关系的过程中，不仅可以了解工艺参数和物料属性与产品CQA之间的关系及对其产生的影响，还有助于确定各个变量及其范围，以确保获得稳定的质量。因此这些工艺参数和物料属性可被选入DS。ICH-Q8(R2)指出，在申报资料中，应该详细介绍DS所考虑到的工艺参数和物料属性，被纳入DS的工艺参数和物料属性，以及它们对产品质量的影响，同时应提供被纳入DS的理由。有些情况下，可能还有必要提供被排除的理由。在DS内的变动，在监管上不被视为变更，不需要上报FDA，这大大减轻了监管监督的负担。而一旦超出DS，则应视为变更，并应启动上市后的变更申请。DS由申报者提出，送交管理当局审评并批准。从这个意义上看，DS的建立和注册办法的简化，是实施QbD的最终目的。对于MSC药品，活细胞的CMA变异性很大（如供体来源的个体差异、活细胞在培养过程中的高度可变性），因此伴随着出现了CPP的在一定范围内的可变性，因为输入材料属性的可变性和CPP之间的复杂相互作用，必须在一定范围内进行相应的调整，于是产生了MSC产品的DS。若以接种密度和培养时间这两个最简单的工艺参数为例，通过综合评价细胞产量和细胞活力，来分析DS的由来。如图6所示，当仅考虑细胞产量这一输出因素时，要拿到同样的细胞数量，接种密度和培养时间呈反比，接种密度越低，所需要的培养时间越长，反之亦然。当仅考虑细胞活力时，因为MSC具有集体生长优势的特征，当细胞接种密度较低时，随着培养时间的延长，细胞活力逐渐提高；然而，当培养时间进一步延长，MSC将会由于接触抑制或者衰老而导致细胞活力的下降，细胞活力整体呈现出下开口抛物线的形状。在干细胞生产中要实现细胞产量和活力的平衡，因此将两条曲线进行叠加，就产生了2个工艺参数的最大DS。在实际生产中，理论上选择DS内任一点作为工艺参数，都应当被认为是可接受的。图6. MSC接种密度和培养时间的DS
当然，影响MSC产品CQA的CMAs和CPPs很多，其DS的确定也比示例要复杂的多，有可能是与时间有关的函数（如图6示例），也可能是一个变量组合（如培养基的选择、培养方式的选择、O2浓度等）。如果DS想要覆盖多个批量规模，也可包含规模因素（实验室规模、中试、商业生产规模等）。分析历史数据能够为建立DS提供依据。无论DS是怎样建立，其目标是只要在DS内操作，都应能使产品达到预定质量要求。
制订CS的目的是确保能持续生产出符合质量要求的产品。基于对产品、处方和工艺的理解，确定和了解会影响产品质量的变异来源，并加以控制。了解变异来源及其对下游的工艺、操作、中间体和制剂质量的影响，有助于将控制移到上游并减少成品检验的需求。这一点对MSC产品的质量控制更为有利，因为MSC成品制剂具有货架期短（通产在12个小时之内）的特点，在产品放行时，如果将MSC的三系分化能力（通常需要1个月出结果）、免疫调控能力（通常需要7~14天出结果）等作为放行控制指标，这显然不现实。当对影响MSC的分化能力的因素有了比较详尽的了解之后，根据风险评估，MSC从原液到制剂这一灌装工序并不会对MSC的分化能力和免疫调控能力产生实质性的影响，那么这两个CQA的控制则可以提前到原液阶段。物料属性（如供体组织、辅料、直接接触药品的包装材料）的控制，以其对工艺性能或产品质量的影响为基础；对下游操作或成品质量有影响的单元操作的控制，如主细胞库的质量检测和稳定性、原液的质量控制；替代成品检验的过程控制或实时放行检验。如在生产过程中持续监测中间体的无菌性，在原液阶段检测MSC的三系分化能力、免疫调控能力，在放行阶段，对产品的理化性质、无菌性、细胞活率、杂质等CQA进行控制；确认多变量预测模型的监控程序（如定期的全面产品检测）。在开展多变量预测模型的监测时，宜采用过程分析技术（Process Analytical Technology, PAT）。FDA将PAT定义为通过测量影响CQA的CPP来设计、分析和控制制药和生物制药生产工艺的系统。PAT的目标是加强对这一制造过程的理解和控制，通过在线、在位和近线测量和控制来缩短生产周期，预防不合格、返工的发生。对于物料、中间产品可以做到实时检测实时放行，提高生产的自动化程度，以改善操作人员安全性并降低人为差错。改善能源和物料的利用效率，并提高产能，促进连续生产工艺的发展。这与FDA目前的药品质量体系具有一致性：不应该在产品中测试药物质量，它应该是内在的，或者是设计好的（QbD）。对于MSC产品而言，PAT可以是一种设计、测量、监控和控制关键过程参数的方法（包括pH、溶解氧、温度、细胞密度、营养水平和代谢物水平），是QbD的一个重要元素。MSC培养是一个动态的过程，宜采用动态CS。动态控制系统需要结合培养响应时间和参数测量时间的适合数学模型，以实现对培养条件的波动进行实时校正和调节，这将有助于促进自动化生产工艺的开发。目前常见的细胞培养生物反应器，基本都配备了对温度、溶氧、pH、葡萄糖、乳酸等CPP的实时监控功能。此外还可以配制在线拉曼光谱分析，对反应器中的细胞密度进行实时监测，以准确判断细胞生长状态，并确定最佳收获时间。QbD允许随着工艺知识的增加，对产品生产过程进行监控和反复优化，持续改进工艺，以保证工艺的稳健性和产品质量的稳定性。在产品的整个生命周期中，制药厂商都有机会去评估创新方法以改进产品质量。可以对工艺性能进行监控，以确保其能够得到DS所预期的QTPP。随着在常规生产中不断获得经验，这种监控可以包括对生产工艺的趋势进行分析。在生产制备过程中，在获得额外的工艺知识后，可能会需要扩展、减少或重新定义DS，以保证持续生产和制备出产品质量一致性的高质量细胞产品。干细胞成药实行QbD的益处
站在监管方角度，对于按照QbD理念开发的药品，监管部门可根据质量风险等级做出评估和明确的决定。
通过前期处方和工艺的认知和研究，FDA对质量控制过程中的风险来源与程度有了较为准确的把握，这将极大减少监管部门的工作量，提高办事效率。在传统的日常评审与监管中，由于处方或工艺变更带来的大量补充申请，耗费了FDA大量的人力、物力和财力。而实施QbD后，FDA对申报项目有了更深刻地了解，对DS范围内的操作变更有了更多信心，可不再进行审批，实行更为宽松的“弹性监管”，切实提高了监管效率。
站在企业角度，QbD虽前期投入大，但从长远来看，QbD的实施有利于企业节约生产成本、提高生产收益和劳动效率。传统生产中，由于没有经过合理科学的试验设计，没有确立CPP，没有建立DS，不合格产品在生产中时有发生，高额罚款和强制召回事件也频见报端。由于设备的改变、物料的变更、环境的差异及生产人员的经验不同，造成产品批次间质量的不稳定。这些可能迫使企业需进行生产变更，变更后的工艺需向监管部门进行补充申请。
实施QbD后，在DS内的改动不用提交补充申请，同时不合格产品和投诉都将大幅减少。此外，生产工艺的灵活性、质量管理的高水准，以及药品质量的高性能，为企业的市场竞争力增加砝码，为后续产品的开发奠定基础，为保护健康、造福社会承担企业自身的社会责任，这些都是企业愿意做的。
QbD的适用现状
目前，按照ICHQ8R2的要求，申报者应该在通用技术文件（CTD）的P.2章节中提交药品研发及相关信息，包括：
1） QRM及产品和工艺研发。比如，在章节P.2.1、P2.2和P.2.3中可以描述物料属性和工艺参数对产品CQA的风险分析和相互关系，在章节P.2.3中可以描述生产工艺设计对产品质量的风险分析。
2) DS。作为拟定生产工艺的一个要素，DS可在申报资料中有关生产工艺和过程控制的章节（P.3.3）予以介绍。如果需要，可在关键步骤和中间体控制的章节（P.3.4）中提供更多的信息。有关产品和生产工艺研发的章节（P.2.1、P.2.2和P.2.3）最适于总结和描述所有关于产品和工艺研发的研究，作为DS的依据。在制剂质量标准的论证章节（P.5.6）中，可以讨论DS与总体CS的关系。此外，还应提供CS和原料药相关信息。
在国内，2020年1月NMPA发布第6号公告：推荐申请人按照ICH《Q8（R2）：药品研发》《Q9：质量风险管理》《Q10：药品质量体系》《Q11：原料药开发和生产（化学实体和生物技术/生物实体药物）》及问答文件的要求开展相关研究。
由此可见，目前国内并未强制要求企业在CTD文档中按照ICHQ8~Q11提交QbD资料。然而，随着国内在药物注册技术标准进一步与国际接轨，有理由相信，在不远的未来，“推荐适用”将很有可能修改为“适用”。未来，或许无论小分子、大分子、生物制品还是细胞药物，都必须按照QbD理念进行研发、生产和质控，都必须在申报和注册的CTD提交QS及对应的制定依据。因此，当下就是实行QbD最好的时机。
长期从事临床级iPSC、成体干细胞制备、质检以及临床转化，干细胞药物申报等方面的研究。现为上海干细胞临床转化研究院研究员，国家干细胞转化资源库副主任，同济大学附属东方医院干细胞基地GMP实验室主任。担任中国认证认可协会干细胞制备与存储服务认证审查员；首届中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会临床级细胞库学组委员；中国整形美容协会干细胞研究与应用分会常务理事；干细胞资源库专业委员会副秘书长。近年发表SCI论文40余篇。授权实用新型专利8项，发明专利4项。主持国家自然科学基金3项，国家重点研发计划课题组长项目1项，国家973项目子课题1项，上海市自然科学基金1项。 长期从事临床级ESC、iPSC、成体干细胞的制备、质量控制以及药学研究，在多种干细胞及其衍生细胞的工艺开发、关键点质控、质量标准制定及GMP体系搭建等方面具有丰富的经验。现任上海市东方医院（同济大学附属东方医院）干细胞基地GMP实验室质控负责人。近年来以第一作者发表SCI论文5篇，申请发明专利8项。
参考资料：
[1] ICH官网 https://database.ich.org/sites/default/files/Q8_R2_Guideline.pdf
[2] FDA官网 https://www.fda.gov/media/77391/download[3] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-7.[4] Yang Y, Lee EH, Yang Z. Hypoxia-Conditioned Mesenchymal Stem Cells in Tissue Regeneration Application. Tissue Eng Part B Rev. 2022 Oct;28(5):966-977长风破浪，一份关于“干细胞疗法发展历程”的完美总结
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